Patchklemme
Patch-Clamp ist ein englischer Begriff für eine elektrophysiologische Technikzur Aufzeichnung von Ionenströmen ,die durch Zellmembranen fließen . Diese Technik besteht darin, eine Glasmikropipette (Kontaktdurchmesser in der Größenordnung von 1 & mgr; m), die mit einerionischen Lösung definierter Zusammensetzung mit der Membran einerisolierten lebenden Zelle gefüllt ist, in elektrische Kontinuität zu bringen. Die Zellen untersucht werden können erregbare Zellen wie beispielsweise Neuronen , Muskelfasern und BetaZellen der Bauchspeicheldrüse , oder nicht-erregbaren Zellen, die auchIonenkanälen an ihrer Oberfläche aufweisen. Durch die Übertragung der Gensequenz (Transfektion) eines interessierenden Ionenkanals in eine Zelle ermöglicht die Technik die Untersuchung der Funktion eines beliebigen Ionenkanals . Diese Technik ermöglicht es, die Funktionsmechanismen der Ionenkanäle einer einzelnen Zelle zu untersuchen, indem die Phänomene des Öffnens, Inaktivierens und Schließens der Kanäle direkt überwacht werden.
Die moderne Version dieser Technik wurde Ende 1970 von Erwin Neher und Bert Sakmann in Götingen perfektioniert und 1991 mit dem Nobelpreis für Physiologie oder Medizin ausgezeichnet. Sie sind die ersten, die die Aktivität einzelner Ionen messen konnten Kanäle, in diesem Fall der ionotrope Acetylcholinrezeptorkanal .
Die Patch-Clamp-Technik kann in zwei Hauptmodi verwendet werden: in angelegter Spannung ( Voltage-Clamp ), die es ermöglicht, den Membranstrom bei einem vom Experimentator bestimmten Potential zu messen, oder in auferlegtem Strom ( Current-Clamp ), was dies ermöglicht Ladungen, die beim Messen des Membranpotentials injiziert werden sollen. Die Technik wird in Hunderten von Forschungslabors auf der ganzen Welt eingesetzt.
Das Messprinzip basiert auf der Verwendung des Ohmschen Gesetzes , wobei U das Potential (oder die Spannung), R der Widerstand und I der Strom ist. Dieses Gesetz wird am häufigsten geschrieben, wenn E = U und die Leitfähigkeit ist. Im Spannungsmodus wird das Potential konstant gehalten und der Strom I gemessen. Die Modifikationen von I hängen direkt von G ab, der interessierenden Menge, da sie direkt von den Eigenschaften des Kanals abhängen. Im auferlegten Strommodus werden die Variationen des Membranpotentials gemessen.
Konfigurationen
Es gibt 4 Patch Clamp- Konfigurationen :
- ganze Zelle ( ganze Zelle auf Englisch): Die makroskopische Aktivität des gesamten Zellstroms wurde gemessen. Ionenkanäle sind die elektrischen Äquivalente von Widerständen in parallel . Die Gesamtleitfähigkeit G ist gleich der Summe jeder Einheitsleitfähigkeit γ multipliziert mit ihrer Öffnungswahrscheinlichkeit. Diese Technik wird angewendet, wenn die Leitfähigkeit der Einheit unter der Nachweisschwelle liegt (ca. 1 Pico Siemens ). Es wird auch verwendet, wenn die biophysikalischen Eigenschaften des Kanals zu komplex sind oder wenn sich die Art der vom Experimentator gestellten Frage auf die Physiologie der Zelle bezieht ;
- Zelle angebracht: Die Mikropipette wird gegen die Membran gedrückt. Das Membranfragment unter der Pipette ist weder wie in der gesamten Zellkonfiguration gebrochen, noch wird die Pipette aus der Zelle entfernt. Diese Konfiguration wird in Fällen verwendet, in denen ein unbekannter Faktor im Zytoplasma erforderlich ist, um die Aktivität des Kanals aufrechtzuerhalten, oder wenn der Kanal die Bindung an Proteine des Zytoskeletts erfordert . Alle anderen Konfigurationen verändern tatsächlich die Umgebung, in der die beiden Seiten des Kanals gebadet werden. Dabei ist das Zytoplasma wenig verändert;
- „ Outside-out “ ( „extern nach außen“ bedeutet), wobei das Membranfragment mit der Messpipette angebracht seine extrazellulären Fläche in Kontakt mit der Außenseite der Pipette hat. Dieses Verfahren wird typischerweise zur Untersuchung von Kanälen verwendet, die durch Bindung eines Liganden aktiviert werden , wie beispielsweise des nikotinischen Acetylcholinrezeptorkanals oder der GABA A- Kanäle . Diese Konfiguration ist schwieriger zu erhalten als die "Inside-Out" -Konfiguration, was erklärt, warum ihre Auswahl auf diese Klasse von Kanälen beschränkt ist.
- " Inside-Out " ( " Inside-Out "), bei dem das an der Messpipette befestigte Membranfragment seine intrazelluläre Fläche in Kontakt mit der Außenseite der Pipette hat. Dies ist die Konfiguration der Wahl für die einheitliche Untersuchung aller Ionenkanäle mit Ausnahme derjenigen, deren Öffnung die Bindung eines Liganden erfordert (siehe oben). Diese beiden letzten Kategorien ermöglichen es, die Aktivität eines einzelnen Ionenkanals zu messen .
Planare Patchklemme
Die Planar Patch Clamp ist eine neue Methode, die für das elektrophysiologische Screening mit hohem Durchsatz entwickelt wurde. Anstatt eine Pipette auf einer anhaftenden Zelle zu positionieren, werden die suspendierten Zellen auf einem Chip abgeschieden, dessen Oberfläche eine Mikroöffnung aufweist, die die Pipette mit einer flachen Oberfläche darstellt.
Eine einzelne Zelle wird dann durch Anlegen von Saugkraft an der Öffnung positioniert und ein enger Kontakt wird gebildet (Gigaseal). Die Geometrie einer ebenen Oberfläche bietet gegenüber herkömmlichen Experimenten eine Vielzahl von Vorteilen - sie ermöglicht die Integration eines Mikrofluidiksystems, das die automatisierte Anwendung von Produkten zum Screening von Ionenkanälen ermöglicht - das System ist auch für optische Techniken oder zugänglich die "Abtastsonde" und ermöglicht auch sowohl extrazelluläre als auch intrazelluläre Perfusion.
Messung von Exozytose und Endozytose durch Überwachung der Membrankapazität
Die Lipiddoppelschichten, die die äußere Zellhülle (Plasmamembran) bilden, und die der intrazellulären Organellen (synaptische Vesikel, sekretorische Granulate, Lysosomen, Zellkern, Lymphozyten, REG ...) bilden zwei Gesichter, die elektrische Ladungen aufweisen ("Köpfe" polare Lipide, hydrophil) getrennt durch eine Isolierfolie (hydrophober Teil der Lipide) kann aus biophysikalischer Sicht als Kondensatoren betrachtet werden, die Ladungen akkumulieren können; Die elektrische Kapazität (ausgedrückt in Farad , Einheit mit dem Symbol: F) einer bestimmten biologischen Membran ist streng proportional zu ihrer Oberfläche. Durch Patch-Clamp-Techniken ist es möglich, die elektrische Kapazität von Objekten zu messen (gesamte Zelle in "Ganzzell" - oder Ganzzellkonfiguration oder das Membranfragment, das unter der Pipette in "Zell-gebundener" Konfiguration oder "gebundener Zelle" vorhanden ist ”.
Somit ist es möglich, in Echtzeit mit Auflösungen in der Größenordnung von ms die Variationen der Membrankapazität (Cm) zu verfolgen, die mit den Prozessen der Exozytose (Fusion intrazellulärer Organellen mit der Plasmamembran) und der Endozytose (Internalisierung von Teilen von) verbunden sind die Plasmamembran) durch Überwachung von Änderungen der Membrankapazität; Während der Exozytose wird die Lipidmembran intrazellulärer Organellen, die mit der Plasmamembran verschmelzen, in elektrische Kontinuität mit dieser gebracht: Die gemessene Membrankapazität nimmt dann zu, so dass der Prozess verfolgt werden kann.
Die Technik der Messung der Exozytose ( Exoklamping ) durch Überwachung der Membrankapazität (Cm) wurde insbesondere in vorhandenen neuroendokrinen Zellen (Beta-Zellen der Bauchspeicheldrüse oder Chromaffinzellen des Nebennierenmarkes) oder des Immunsystems (Mastzelle) intensiv durchgeführt im Vergleich zu Neuronen der Vorteil einfacher Geometrien (im Wesentlichen kugelförmig und von reduzierter Größe), die eine räumlich homogene Fixierung der experimentell angelegten Spannung fördern ("Space-Clamp"); Umgekehrt erschweren Zellen mit komplexen Geometrien (z. B. bestimmte sehr verzweigte Neuronen) oder großen Dimensionen (z. B. bestimmte Muskelzellen) die räumliche Fixierung der Spannung (Kabeleffekt), was die Schwierigkeit erklärt, dort die Variationen von Cm genau zu messen. In bestimmten Zellen mit kleinen Größen (~ 10/20 µm) und großen intrazellulären Organellen (mehrere hundert nm Durchmesser; Mastzellen, Chromaffinzellen zum Beispiel) kann die Überwachung der Membrankapazität die Messung von Ereignissen ermöglichen, die eine einzigartige Exozytose verursachen, insbesondere in "Cell-Attached" -Konfiguration.
Anmerkungen und Referenzen
- [PDF] Planare Patchklemme .
Siehe auch
Zum Thema passende Artikel
Externe Links
- (de) Planare Patchklemme
- (de) Beschreibung des Geräts