Die Fosmid sind Vektoren künstlichen eines aus Plasmid - Hybrid. Sie ähneln Cosmiden , basieren jedoch auf dem F-Plasmid anstelle der cos- Sequenz des Phagen Lambda . Der Klonierungsvektor ist begrenzt, da ein Wirt (normalerweise E. coli ) nur ein Fosmidmolekül enthalten kann. Fosmide können DNA- Inserts bis zu 40 kb enthalten ; häufig ist die Quelle des Inserts zufällige genomische DNA . Eine Fosmidbibliothek wird hergestellt, indem genomische DNA aus dem Zielorganismus extrahiert und in den Fosmidvektor kloniert wird. Das Ligationsgemisch wird dann in Phagenpartikel verpackt und die DNA wird in den bakteriellen Wirt transfiziert. Bakterienklone (die aus der Reproduktion des ursprünglichen Wirts resultieren) vermehren die Fosmidbibliothek. Die niedrige Kopienzahl bietet eine höhere Stabilität als Vektoren mit relativ höheren Kopienzahlen, wie z. B. Cosmide. Fosmide können nützlich sein, um stabile Bibliotheken aus komplexen Genomen aufzubauen . Sie besitzen eine hohe strukturelle Stabilität und es wurde gezeigt, dass sie die menschliche DNA auch nach 100 Generationen Bakterienwachstum wirksam erhalten. Fosmidische Klone wurden verwendet, um die Genauigkeit der öffentlichen Sequenz des menschlichen Genoms zu bewerten.
Das Fertilitätsplasmid oder F-Plasmid wurde von Esther Lederberg entdeckt und codiert Informationen für die Biosynthese des Sexualpilus , um die bakterielle Konjugation zu erleichtern . Dies besteht darin, den Sexualpilus zu verwenden, um eine Brücke zwischen zwei Bakterienzellen zu bilden; Diese Brücke ermöglicht es der F + -Zelle (die das F-Plasmid besitzt), eine einzelsträngige Kopie des Plasmids zu übertragen, so dass die beiden Zellen letztendlich jeweils eine Kopie des Plasmids enthalten. Während seiner Übertragung auf die Empfängerzelle wird der entsprechende DNA-Strang vom Empfänger synthetisiert. Die Spenderzelle behält eine funktionelle Kopie des Plasmids. Es wurde später festgestellt, dass Faktor F das erste Episom ist (gleiche Eigenschaften wie Plasmide, aber zusätzlich in der Lage, sich in zirkuläre Chromosomen zu integrieren) und als unabhängiges Plasmid existieren kann, was es zu einem sehr stabilen Vektor für die Klonierung macht. Die Konjugation unterstützt die Bildung von bakteriellen Klonbanken, indem sichergestellt wird, dass alle Zellen das gewünschte Fosmid enthalten.
Fosmide sind DNA-Vektoren, die die ursprünglichen Replikations- und Verteilungsmechanismen des F-Plasmids verwenden, um die Klonierung großer DNA-Fragmente zu ermöglichen. Es ist daher leicht möglich, eine Bibliothek herzustellen, die eine 20- bis 70-fach redundante Abdeckung des Genoms bietet.
Der erste Schritt bei der Sequenzierung des gesamten Genoms besteht darin, das Genom in überschaubare Größeneinheiten mit einer Länge von 50 bis 200 Kilobasen zu klonieren. Aufgrund seiner Stabilität und der Beschränkung auf ein Plasmid pro Zelle ist es ideal, eine Fosmidbibliothek zu verwenden. Durch die Begrenzung der Anzahl von Plasmiden in den Zellen wird das Rekombinationspotential verringert, wodurch die Insertion des Genoms erhalten bleibt.
Fosmide enthalten mehrere Funktionselemente:
Die Methoden zum Schneiden und Einfügen von DNA in Fosmidvektoren wurden im Laufe der Zeit perfektioniert. Mittlerweile gibt es viele Unternehmen, die in relativ kurzer Zeit aus jeder DNA-Probe eine Fosmidbibliothek zu relativ geringen Kosten erstellen können. Dies hat sich als entscheidend erwiesen, damit Forscher viele Genome für Studien sequenzieren können. Durch eine Vielzahl von Methoden wurden über 6.651 Organismusgenome vollständig sequenziert, und 58.695 werden gerade sequenziert.
Manchmal ist es schwierig, einzelne Chromosomen anhand ihrer Länge, ihres Armverhältnisses ( Zentromerposition ) und ihres C-Bandenmusters genau zu unterscheiden . Fosmide können als zuverlässige zytologische Marker für die Identifizierung einzelner Chromosomen und Karyotypen von Metaphasenchromosomen basierend auf Fluoreszenz verwendet werden In-situ-Hybridisierung kann verwendet werden, um zu überprüfen, ob die Positionen dieser Fosmide erfolgreich konstruiert wurden.
Das Fosmidsystem eignet sich hervorragend zur schnellen Erstellung chromosomenspezifischer Mini-BAC-Bibliotheken aus flusssortierter chromosomaler DNA. Der Hauptvorteil von Fosmiden gegenüber anderen Cosmidsystemen ist ihre Fähigkeit, Fragmente menschlicher DNA stabil zu vermehren. Die menschliche DNA ist von Natur aus sehr repetitiv und für ihre extreme Instabilität in Mehrfachkopie-Vektorsystemen bekannt. Es wurde festgestellt, dass die Stabilität dramatisch zunimmt, wenn humane DNA-Inserts in Einzelkopien in rekombinant defizienten E. coli- Zellen vorhanden sind . Daher dienen Fosmide als zuverlässige Substrate für die genomische DNA-Sequenzierung in großem Maßstab.