Die Immunfluoreszenz ist eine Technik der Immunfärbung , bei der sowohl Antikörper als auch Fluorochrome verwendet werden . Die Immunfluoreszenz ermöglicht es, ein bestimmtes Protein direkt in der Zelle durch Emission von Fluoreszenz freizulegen . Es ist daher möglich, nicht nur das Vorhandensein oder Fehlen eines Proteins zu bestimmen, sondern auch dessen Position in der Zelle oder im analysierten Gewebe.
Das Fluoreszenz Phänomen wurde in der Mitte des entdeckten XIX - ten Jahrhunderts von dem englischen Wissenschaftlern Sir George Gabriel Stokes . Er war der erste, der beobachtete, dass Fluorit , ein Mineral , fluoresziert, wenn es ultravioletten Strahlen ausgesetzt wird , und gab ihm den Namen "Fluoreszenz".
Die erste Arbeit mit Immunfluoreszenz geht auf die 1950er Jahre zurück, als Antikörper an Fluorochrome chemischer Natur wie Fluorescein konjugiert wurden .
Die ersten fluoreszierenden Proteine (ähnlich den bei der Immunfluoreszenz verwendeten Fluorochromen) wurden viel später mit GFP ( Green Fluorescent Protein ) in den 1960er Jahren von Osamu Shimomura und Roger Y. Tsien entdeckt . Die Entdeckung dieses Proteins, das von einer Qualle ( Aequorea victoria ) stammt, brachte ihnen 2008 den Nobelpreis für Chemie ein. Heutzutage sind viele in der Immunfluoreszenz verwendete Fluorochrome Derivate von GFP.
Es gibt zwei Arten von Fluoreszenz. Zuallererst die sogenannte "natürliche" Fluoreszenz oder Autofluoreszenz, die spontan von der Zelle emittiert wird. Beispielsweise kann das Chlorophyll von Pflanzenzellen erwähnt werden. Dann gibt es die Fluoreszenz, die durch ein Fluorochrom verliehen wird, eine chemische Substanz, die Licht emittiert, wenn es bei einer bestimmten Wellenlänge angeregt wird.
Bei der Immunfluoreszenz können zwei Arten der Markierung durchgeführt werden. Die erste ist die direkte Immunfluoreszenz. Während dieser Markierung wird ein gegen das gewünschte Molekül gerichteter Antikörper, Antigen genannt, verwendet. Dieser Antikörper ist an ein Fluorochrom gekoppelt. Um das Präparat zu enthüllen, kann man ein Epifluoreszenzmikroskop oder ein konfokales Mikroskop verwenden. Diese Technik bleibt eine der am häufigsten verwendeten in der wissenschaftlichen Forschung.
Die indirekte Immunfluoreszenz (IFI) basiert auf der sukzessiven Verwendung von 2 Antikörpern: Der erste Antikörper vom monoklonalen Typ erkennt spezifisch das interessierende Protein. Der zweite Antikörper vom polyklonalen Typ ist gegen den primären Antikörper (den ersten) gerichtet.
Dies ist die zweite Markierung. In diesem Fall haben wir zwei Antikörper. Der primäre Antikörper ist gegen das gewünschte Antigen gerichtet. Dann wird ein zweiter Antikörper verwendet, der mit einem Fluorochrom markiert ist und eine hohe Affinität für den primären Antikörper aufweist (gegen den Isotyp des primären Antikörpers gerichtet, ist es dann ein Antiglobulin ).
Als Vorteile besteht die Möglichkeit, mehrere Markierungen an derselben Zellprobe durchzuführen, die Geschwindigkeit und die Benutzerfreundlichkeit dieses Verfahrens sowie seine gute Zuverlässigkeit. Darüber hinaus nimmt bei der indirekten Immunfluoreszenz die Lichtintensität zu, da auf den Primärantikörpern mehrere Bindungsstellen vorhanden sind, wodurch mehrere Sekundärantikörper an sie gebunden werden können.
Es gibt jedoch einige Nachteile. Zum Beispiel die Möglichkeit falsch positiver oder falsch negativer Reaktionen, die subjektive Einschätzung des Fluoreszenzgrades und das Phänomen der Photobleichung. Um diese Nachteile zu überwinden, gibt es verschiedene Techniken. Führen Sie zunächst eine Negativkontrolle für die indirekte Immunfluoreszenz durch, dh setzen Sie nur die sekundären (markierten) Antikörper in Kontakt mit der zu analysierenden Probe. Wenn die Negativkontrolle nach einem Waschschritt gut ist, sollte sie keine Fluoreszenz emittiert haben, da die Sekundärantikörper nicht binden konnten und daher nach dem Waschschritt abreisten. Die Verwendung einer hochauflösenden und hochempfindlichen Kamera schwächt dann das Photobleichen ab und ermöglicht eine quantitative Untersuchung der Erfassung.
Obwohl das Prinzip der Immunfluoreszenz einfach ist, müssen in der Praxis viele Faktoren berücksichtigt werden.
Wir können drei Bereiche unterscheiden:
Immunfluoreszenz wird an Zellen in Kultur (wir werden dann von Immunzytochemie sprechen ) oder an Gewebeschnitten ( Immunhistochemie ) verwendet.